La microscopia multifotonica si basa sull'eccitazione dei campioni attraverso un processo di assorbimento simultaneo di due o più fotoni, e sulla successiva rivelazione della luce emessa per fluorescenza.

I processi di assorbimento di due (o più) fotoni avvengono solo laddove l'intensità della luce incidente sia estremamente elevata, ovvero solo nelle strette vicinanze del punto focale di un fascio laser focalizzato. Di conseguenza, solo il piccolissimo volume di campione (detto "voxel") che si trova nello stretto intorno del punto focale viene eccitato, e solo questo voxel sarà responsabile dell'emissione di fluorescenza. I piccoli volumi di cui si parla sono dell'ordine del femtolitro (dimensione lineare dell'ordine di grandezza di qualche centinaio di nm).

La tecnica di microscopia multifotonica possiede quindi una intrinseca capacità di risoluzione tridimensionale. Scansionando il campione tridimensionalmente, voxel per voxel, si può di conseguenza ricostruire l'immagine di fluorescenza dello stesso.

La sorgente utilizzata per la microscopia multifotonica deve essere un laser che emetta impulsi ultrabrevi (per assicurare che due o più fotoni possano venire assorbiti simultaneamente) e possibilmente di lunghezza d'onda accordabile. Occorre tenere presente che, siccome due fotoni vengono assorbiti per provocare una transizione del campione, la frequenza dei fotoni deve essere la metà rispetto a quella che si utilizzerebbe per provocare un'eccitazione a singolo fotone. Le frequenze tipiche che sono necessarie cadono quindi tipicamente nel vicino infrarosso. La radiazione che cade in tale zona spettrale, inoltre, ha la caratteristica di avere una penetrazione all'interno dei tessuti biologici fino a qualche mm (grazie allo scarso assorbimento e al limitato scattering rispetto alla luce visibile o UV), permettendo di indagare parti profonde (fino a un paio di mm) dei tessuti senza bisogno di sezionarli o chiarificarli. Per questo motivo la tecnica si presta anche per l'indagine in-vivo.

Facility for MultiPhoton Imaging

Main parts:

- Femtosecond pulsed laser Coherent Chameleon Discovery (tunable wavelength output 660-1320 nm; fixed wavelength output @ 1040 nm)
- Two-Photon Microscope Nikon A1R MP+ Upright

Details:

- High-Resolution Galvanometer Scanner (up to 4096 x 4096 pixels)

- Ultrahigh Speed Resonant Scanner (up to 420 frames per second)

- 4 non-descanned detectors for Blue, Green, Red and Far Red

- Detector for spectral acquisition

- 25x water-dipping objective (NA = 1.1)